Fluorescencia molecular fluorometros y espectrofluorometros - Por: dani77

Teoría de las fluorescencias

Pueden hallarse ejemplos de comportamiento fluorescente en sistemas químicos simples y complejos en los estados gaseoso. Líquido y sólido, el tipo más sencillo de fluorescencia es el que presentan los vapores atómicos diluidos. Por ejemplo, los electrones 3s de los átomos de sodio vaporizado pueden ser excitados al estado 3p por absorción de la radiación de 5896 y 5890Å. Transcurrido un tiempo medio de 10-8seg, los electrones vuelven al estado fundamental y al hacerlo emiten radiación de las mismas dos ondas de longitud, en todas las direcciones. Este tipo de fluorescencia, en el que la radiación absorbida se emite de nuevo sin alteración, se conoce como radiación de resonancia o fluorescencia de resonancia.
Las moléculas o iones poliatómicos también presentan radiación también; además es emitida una radiación característica que posee longitud de onda mayor. Este fenómeno se denomina variación de Stokes.

Instrumentos para el análisis de la fluorscencia

Los distintos componentes de los fluotómetros son semejantes a los que existen en los fotómetros o espectrofotómetros de ultravioleta y visible. La figura 1 muestra la configuración característica de los componentes de un fluorómetro o un espectrofluorómetro. Prácticamente todos los instrumentos de fluorescencia emplean óptica de doble haz para compensar las variaciones en la potencia de la fuente. El haz de la muestra pasa primero a través de un filtro de excitación o un monocromador que sirve para transmitir aquella parte del haz que excitará la fluorescencia, excluyendo las longitudes de onda que se producirán posteriormente en la muestra irradiada. La muestra emite radiación fluorescente en todas direcciones, pero se observa mejor perpendicularmente al haz de excitación; en otro ángulo el aumento de la dispersión a partir de la solución y las paredes de la celda es probable que cause grandes errores en la medición de la intensidad de la fluorescencia. La radiación emitida llega a un detector fotoeléctrico después de atravesar un segundo filtro o sistema monocromador que aísla el pico fluorescente.
El haz de referancia pasa a través de un atenuador que reduce su potencia a valores que se aproximan a los de la radiación fluorescente (la reducción de la potencia es por lo general de 100 veces o más). Las salidas de los fototubos de referencia y de muestra alimentan un amplificador diferencial cuya salida pasa a un instrumente de medida o registro. Muchos instrumentos de fluorescencia son de compensación a cero, situación que se logra por medio de atenuadores ópticos o eléctricos.
La complejidad, las carecterísticas de funcionamiento y los costos de los fluorómetros y espectrofluorómetros difieren tanto como los correspondientes instrumentos para mediciones de absorción. Los fluorómetros son análogos a los fotómetros de absorción en cuanto a que se emplean filtros para restringir las longitudes de onda de los haces de excitación y emisión. Los espectrofluorómetros son de dos tipos. El primero emplea un filtro apropiado para limitar la radiación de excitación, y una rejilla o monocromador de prisma para aislar un pico del espectro de emisión fluorescente. Pueden adquirirse varios espectrofotómetros comerciales con adaptadores que permiten sus uso de este modo.
Los verdaderos espectrofluorómetros son instrumentos especializados equipados con dos monocromadores. Uno de ellos sirve para restringir la radiación de excitación a una estrecha banda; el otro permite aislar una longitud de onda determinada de la emisión fluorescente. Estos instrumentos permiten medir los espectros de fluorescencia, excitación y absorción. Se obtiene un espectro de excitación cuando el monocromador de emisión está fijo a una longitud de onda que produce una intensa fluorescencia; se obtiene entonces, una gráfica de la intensidad de la fluorescencia en función de la longitud de onda de excitación. Por otra parte, se obtiene el espectro de fluorescencia a una longitud de excitación fija recorriendo las longitudes de onda de la emisión fluorescente. Cuando se realizan las correcciones correspondientes para compensar las variaciones de la intensidad de la fuente en función de la longitud de onda, se obtiene un espectro de excitación absoluta de la muestra, que es semejante al espectro de absorción.
La selectividad proporcionada por estos instrumento es de capital importancia en las investigaciones relacionadas con las características electrónicas y estructurales de las moléculas, y también tiene valor para el trabajo analítico tanto cualitativo como cuantitativo.
Sin embargo, para fines cuantitativos la información proporcionada por instrumentos más sencillos es enteramente satisfactoria. En realidad, los fluorómetros relativamente económicos diseñados específicamente para resolver los problemas de medición peculiares al análisis fluorescente son con frecuencia tan específicos y selectivos como los espectrofotómetros modificados.
La exposición que sigue se enfoca principalmente sobre los instrumentos más sencillos para análisis de fluorescencia.

Componentes de los fluorómetros y espectrofluorómetros

Los componentes de los fluorómetros y espectrofluorómetos difieren sólo en detalle de los de los fotómetros y espectrofotómetros, por lo que sólo es necesario considerar estas diferencias:

Fuentes. En muchas aplicaciones se necesita una fuentes más intensa que la lámpara de tungsteno o de hidrógeno empleada para medir la absorción, y por lo general se emplea una lámpara de arco de mercurio o en ciertos casos de xenón.
La lámpara de arco de xenón produce radiación intensa por le paso de corriente por una atmósfera de xenón. El espectro es continuo en la gama comprendida entre 250 y 600 nm con un máximo a 470 nm. En algunos instrumentos se obtienen destellos espaciados regularmente por medio de la descarga de un condensador a través de la lámpara; con esto se logran altas intensidades; además, la salida de los fototubos es en estos casos unas señal alterna que se amplifica y se procesa fácilmente.
Las lámparas de arco de mercurio producen un intenso espectro de líneas. Las lámparas de alta presión (~ 8 atmósferas), dan líneas a 366, 405, 436, 546, 577, 691 y 773 nm. Las lámparas de baja presión, con ventanas de sílice, proporcionan intensa radiación adicional a 254 nm. Siempre que pueda inducirse la fluorescencia en muchos compuestos fluorescentes por medio de diferentes longitudes de onda por lo menos una de las líneas del mercurio suele ser apropiada.
Un progreso reciente consiste en el uso de diferentes tipos de laceres como fuentes de excitación para fluorometría. Tiene especial interés, un láser de colorante sintonizable que utiliza como fuente primaria, un láser pulsante de nitrógeno. Se produce entonces una radiación comprendida en la región entre 360 y 650 nm este dispositivo elimina la necesidad de utilizar un monocromador de excitación.

Filtros y monocromadores. Los filtros de interferencia y de absorción han sido empleados en los fluorómetros. Muchos fluorómetros poseen monocromadores de rejilla.

Detectores. La señal fluorescente típica es de baja intensidad; se requieren así grandes factores de amplificación para su medición. En los instrumento de fluorescencia sensible han llegado a generalizarse como detectores de tobos fotomultiplicadores.

Celdas y compartimientos de celdas. Se emplean celdas cilíndricas y rectangulares construidas de vidrio o sílice par las mediciones de fluorescencia. En el diseño del compartimiento de celdas debe procurarse reducir la cantidad de radiación dispersa que llega al detector. Para este fin, se suelen introducir deflectores en el compartimieto.

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